淋病

　　淋病症状诊断

一、分类：

　　 1.单纯型淋病 即无合并症的淋病患者。

　　1)男性淋病：

　　①男性急性淋病：

　　潜伏期一般为2～10天，平均2～5天。开始尿道口灼痒、红肿及外翻。排尿时灼痛，伴尿频，尿道口有少量黏液性分泌物。3～4天后，尿道黏膜上皮发生多数局灶性坏死，产生大量脓性分泌物，排尿时刺痛，龟头及包皮红肿显著。尿道中可见淋丝或血液，晨起时尿道口可结脓痂。伴轻重不等的全身症状。

　　②男性慢性淋病：

　　一般多无明显症状，当机体抵抗力减低，如过度疲劳、饮酒、性交时，即又出现尿道炎症状，但较急性期炎症轻，尿道分泌物少而稀薄，仅于晨间在尿道口有脓痂黏附，即“糊口”现象。

　　由于尿道长期存在炎症，尿道壁纤维组织增生而形成瘢痕，前尿道形成多处瘢痕时，使分泌物不能通畅排出，炎症易向后尿道、前列腺及精囊扩延，并发前列腺炎、精囊炎，甚至逆行向附睾蔓延，引起附睾炎。排尿终了时尿道中常混有来自后尿道的淋菌，因此，后尿道炎和前列腺炎又为前尿道炎的传染源。由于前列腺和精囊的分泌物排人后尿道，并不断刺激后尿道，使其不断增厚，反过来又影响腺管引流不畅。这样相互影响，促使淋病病程迁延，不易治愈，并成为重要的传染源。

　　2)女性淋病：

　　①女性急性淋病：

　　感染后开始症状轻微或无症状，一般经2～3天的潜伏期后，外阴部首先发炎，自觉瘙痒，行走时疼痛，相继出现尿道炎、宫颈炎、尿道旁腺炎、前庭大腺炎及直肠炎等，其中以宫颈炎最常见。70%的女性淋病患者存在尿道感染。淋菌性宫颈炎常见，多与尿道炎同时出现。

　　②女性慢性淋病：

　　急性淋病如未充分治疗可转为慢性。表现为下腹坠胀、腰酸背痛、白带较多等。

　　③妊娠合并淋病：

　　多无临床症状。患淋病的孕妇分娩时，可经过产道而感染胎儿，特别是胎位呈臀先露时尤易被感染，可发生胎膜早破、羊膜腔感染、早产、产后败血症和子宫内膜炎等。

　　④幼女淋菌性外阴阴道炎：外阴、会阴和肛周红肿，阴道脓性分泌物较多，可引起尿痛、局部刺激症状和溃烂。

　　2.有合并症型淋病

即伴泌尿生殖系合并症的淋病患者。

　　1)男性淋病的合并症：

　　①淋病合并症前列腺炎和淋病合并症精囊炎：如精囊受累，精液中可混有血液。并发前列腺炎时，会阴部疼痛，直肠指诊前列腺肿大、疼痛，精囊腺肿大。

　　②淋菌性附睾炎与尿道球腺炎：附睾疼痛、肿大及触痛。并发尿道球腺炎时，会阴部可触及肿大腺体，患者感不适或钝痛。并发急性附睾炎时，阴囊红肿、疼痛，附睾肿痛，精索增粗。

　　③淋菌性包皮龟头炎：脓性分泌物的刺激可引起龟头和包皮炎症。

　　④腺性尿道炎、潴留囊肿、淋巴管炎、淋巴结炎及包皮腺脓肿：前尿道的隐窝及腺体可受侵犯，称为腺性尿道炎。这些腺体如被堵塞，可形成潴留囊肿，囊肿破裂后可形成尿道周围囊肿。尿道旁腺或尿道周围炎症可向阴茎海绵体扩延，常并发淋巴管炎、单侧或双侧腹股沟淋巴结炎。阴茎系带两侧的包皮腺也可被累及而形成脓肿。

　　2)女性淋病及其合并症：

　　①淋菌性前庭大腺炎：前庭大腺开口处红肿、向外突出，有明显压痛及脓性分泌物，严重者腺管口被脓性分泌物堵塞而不能排泄，形成前庭大腺脓肿，有明显疼痛，行动时感困难，可伴发热、全身不适等症状。

　　②淋菌性尿道旁腺炎：挤压尿道旁腺处有脓性分泌物从尿道外口流出。

　　③淋菌性肛周炎：阴道分泌物较多时可引流至肛周和会阴引起炎症。

　　④淋菌性盆腔炎性疾病(gonococcal pelvic inflammatory disease，GPID)：包括急性输卵管炎、子宫内膜炎、继发性输卵管卵巢脓肿、盆腔腹膜炎和盆腔脓肿等。10%～15%的淋菌性子宫内膜炎可上行感染，发生淋菌性盆腔炎、输卵管炎、卵巢炎、附件炎及宫体炎。可引起输卵管阻塞、积水及不孕。如与卵巢粘连，可导致输卵管卵巢脓肿，一旦脓肿破裂可引起化脓性腹膜炎。66%～77%的盆腔炎多发生于月经后，主要见于年轻育龄妇女。典型症状为双侧下腹剧痛，一侧较重，发热、全身不适，发热前可有寒战，常伴食欲不振、恶心和呕吐。患者多有月经延长或不规则阴道出血，脓性白带增多等。

　　3.泌尿生殖器外型淋病

　　1)淋菌性结膜炎：多见于新生儿和成人，结膜充血、水肿，有脓性分泌物，严重者可致角膜溃疡和失明。新生儿在分娩通过产道时引起淋病性结膜炎，在出生后1～14天发生，表现为双眼睑明显红肿，有脓性分泌物溢出，如未及时治疗，可累及角膜，形成角膜溃疡和角膜白斑，导致失明。

　　2)淋菌性咽炎：多无症状，有症状者可表现为咽喉部红肿、水疱、脓疱和脓性分泌物。

　　3)淋菌性直肠炎：多为肛门瘙痒和烧灼感，排便疼痛，排出黏液和脓性分泌物，直肠充血、水肿、脓性分泌物、糜烂、小溃疡及裂隙。

　　4)淋球菌性腹膜炎单侧或两侧下腹部疼痛，少数为转移性下腹部疼痛，但较其他腹膜炎轻。常尿频、尿急、尿痛、尿道灼痛，既往在半年内常有类似症状。有不洁性接触病史。

　　5)淋病性关节炎：多累及膝、踝、肘、腕和肩关节。 2/3表现为游走性不对称性关节炎，约1/4表现为单关节痛。关节炎时关节红、肿、积液或积脓，可引起骨质破坏和关节强直。常伴滑膜炎和腱鞘炎

　　4.播散型淋病 即播散性淋球菌感染，占淋病患者的0.2%～1.9%。低中度发热，体温多在39℃以下，可伴乏力、食欲下降等其他症状。

　　5.淋病后综合征(postgonorrhea syndrome，PGS) 指淋病治疗后实验室检查阴性而仍有某些症状或体征者。有尿道炎样、前列腺炎样症状。

　　二、诊断标准：

　　淋病的诊断必须结合病史、体格检查、实验室检查结果综合分析才能作出。

　　淋病疾病病因

(一)发病原因

　　传染途径：

　　1、通过性接触传染

　　成人特别是男性淋病99%-100%属于性交传染。传播速度快，而且感染率很高，感染后3-5天即可发病。感染人群中以青壮年为主。

　　目前，我国以暗娼为主要传染源。调查资料表明，在淋病患者中男女一次性交感染率为22%-35%;男女双方感染率是男性易于传染给女性。

　　2、非性接触传染

　　此种情况较少，主要是接触病人含淋病双球菌的分泌物或被污染的用具，如沾有分泌物的毛巾、脚布脚盆、衣被，甚至于厕所的马桶圈等均可传染。特别是女性(包括幼女)，因其尿道和生殖道短，很易感染。

　　病原体：　

　 1.发现 1879年，奈瑟从35例急性尿道炎、阴道炎及新生儿急性结膜炎病人的分泌物中，分离出淋病双球菌。1885年，Bumm在人、牛或羊的凝固血清培养基上培养淋球菌获得成功，将菌种接种于健康人的尿道内也可产生同样的症状。至此，淋球菌是淋病的病原体的结论始告成立。

　　2.形态与染色 淋球菌呈卵圆形或豆形，菌体长0.6～0.8微米，宽约0.5微米。常成对排列，邻近面扁平或稍凹陷，像两粒豆子对在一起。无鞭毛，不形成芽孢。在急性感染的机体内，其形态较典型，多位于细胞浆内。慢性期则在细胞外。淋球菌革兰染色阴性。用碱性美蓝染色时，菌体呈蓝色。用Pappehheim Saathof染色时，菌体呈红色，背景为天蓝色，十分清晰。

　　淋球菌在人工培养基上有五种不同的菌落形态，分别称为T1，T2，T3，T4，T5，其中T1和T2有毒力，T3和T4无菌毛，不能感染人类。

　　3.菌体结构 淋球菌的致病主要与菌体外面的结构有密切关系。淋球菌外面结构为外膜，外膜的主要成分为膜蛋白、脂多糖和菌毛。膜蛋白可使淋球菌黏附于人体黏膜上，通过细胞吞噬作用进人细胞，在细胞内大量繁殖，导致细胞崩解，淋球菌扩散到黏膜下层引起感染。菌毛易黏附于子宫腔和口腔上皮细胞表面，有致病力及传染性。

　　4.培养与生化特性 在含有动物蛋白质如血液、血清、蛋黄、腹水等的培养基上生长良好。培养的适宜温度为35～36℃，适宜pH为7.5，需要在5%二氧化碳的环境中培养。

　　在人体尿道中可使葡萄糖发酵，但不能使果糖发酵，因此，可利用这一特性作葡萄糖发酵试验，以与脑膜炎双球菌鉴别。淋球菌不产生靛基质及硫化氢，在生长过程中可产生氧化酶，这在早期鉴定有一定意义。

　　5.营养分型 根据淋球菌培养时所需要的氨基酸和核酸营养基础，可将淋球菌分为35个营养型，其中Arg、Hyx、Ura型淋球菌可引起无症状淋病及播散性淋病，对血清具有抗力，但对青霉素及其他一些药物则敏感。

　　6.抵抗力 淋球菌较为娇嫩，最怕干燥，适宜在潮湿、温度为35～36℃、含2.5%～5.0%二氧化碳的条件下生长，其生长的最适pH为7.0～7.5。淋球菌对外界理化因素的抵抗力相当差，在完全干燥的环境中1～2h即死亡，但若附着于衣裤和被褥中，则能生存18～24h，在厚层脓液或湿润的物体上可存活数天。在50℃仅能存活5min。淋球菌对常用的黏膜杀菌剂抵抗力很弱。它对可溶性银盐尤其敏感，1∶4000硝酸银溶液可使其在7min内死亡，使脓液中的淋球菌2min内死亡。1%苯酚(石炭酸)溶液能在3min内将其杀灭。除耐药菌株外，淋球菌对抗生素敏感，但抗生素的最小抑菌浓度逐渐有所提高。

　　(二)发病机制

　　1.发病机制

　　(1)对上皮的亲和力：淋球菌对柱状上皮和移行上皮有特别的亲和力。男女性尿道，女性宫颈覆盖柱状上皮和移行上皮，故易受淋球菌侵袭，而男性舟状窝和女性阴道为复层扁平上皮覆盖，对其抵抗力较强，一般不受侵犯，或炎症很轻，故成年妇女淋菌性阴道炎少见。幼女由于阴道黏膜为柱状上皮，因此易于受染。皮肤不易被淋球菌感染，罕见有原发性淋球菌皮肤感染。人类对淋球菌无先天免疫性，痊愈后可发生再感染。

　　(2)黏附：淋球菌菌毛上的特异性受体可与黏膜细胞相应部位结合;其外膜蛋白Ⅱ可介导黏附过程;它还可释放IgAl分解酶，抗拒细胞的排斥作用。这样，淋球菌与上皮细胞迅速黏和。微环境中的酸碱度、离子桥、疏水结构和性激素等也可促进黏附过程。

　　(3)侵入与感染：淋球菌吸附于上皮细胞的微绒毛，其外膜蛋白I转移至细胞膜内，然后淋球菌被细胞吞噬而进入细胞内。淋球菌菌毛可吸附于精子上，可迅速上行到宫颈管。宫颈管的黏液可暂时阻止淋球菌至宫腔，而在宫颈的柱状上皮细胞内繁殖致病。淋球菌一旦侵入细胞，就开始增殖，并损伤上皮细胞。细胞溶解后释放淋球菌至黏膜下间隙，引起黏膜下层的感染。

　　(4)病变形成：淋球菌侵人黏膜下层后继续增殖，约在36h内繁殖一代。通过其内毒素脂多糖、补体和IgM等协同作用，形成炎症反应，使黏膜红肿。同时，由于白细胞的聚集和死亡，上皮细胞的坏死与脱落，出现了脓液。腺体和隐窝开口处病变最为严重。

　　(5)蔓延播散：淋球菌感染后造成的炎症可沿泌尿、生殖道蔓延播散，在男性可扩展至前列腺、精囊腺、输精管和附睾，在女性可蔓延到子宫、输卵管和盆腔。严重时淋球菌可进入血液向全身各个组织器官播散，导致播散性感染。

　　2.耐药机制

　　(1)耐药菌株的类型：到目前为止，发现了4种耐药性淋球菌菌株。

　　①PPNG菌株：为由细菌的质粒介导的耐青霉素菌株。近年来，已分离出不同质粒型的PPNG菌株。

　　②CMRNG菌株：是由细菌染色体介导的耐药菌株。其耐药谱广泛，包括青霉素、四环素、头孢菌素、链霉素和大观霉素等。

　　③TRNG菌株：为由细菌质粒介导的耐四环素菌株。

　　④耐氟喹诺酮菌株：是由细菌染色体介导的耐药菌株，耐药谱包括环丙沙星、氟哌酸和氧氟沙星(氟嗪酸)等。

　　(2)耐药菌株产生的原因：

　　①PPNG菌株：该菌株具有一种染色体外遗传物质，称质粒，系由嗜血菌属获得的控制酶所产生，并可遗传给后代。质粒使胞质中携带耐药性的基因R因子突变，从而带有产生β-内酰胺酶的密码。此酶可裂解青霉素的β-内酰胺环，使其失去抗菌作用。

　　②CMRNG菌株：淋球菌染色体中的许多遗传位点都可发生基因突变，从而改变了药物作用位点，导致耐药性的产生。

　　③TRNG菌株：其耐药原因的具体细节尚不清楚。

　　④耐氟喹诺酮菌株：涉及淋球菌染色体中数个遗传位点的基因突变，不同位点的联合突变决定耐药的程度和方式。已报道有3种耐药机制：gyrA基因编码的DNA旋转酶A亚单位发生突变;parC基因编码的DNA拓扑异构酶Ⅳ发生突变;细胞内药物累积量减少。

　　(3)促使淋球菌耐药的因素：

　　①抗生素剂量不足：使淋球菌长期处于亚治疗剂量的作用下，日久便产生对青霉素类的耐药性。

　　②滥用抗生素进行预防：已证明，随意使用青霉素作化学预防很容易促进青霉素耐药菌株的产生。

　　③抗生素多剂量治疗：抗生素多剂量治疗更易在体内选择出氟喹诺酮类耐药性增高的淋球菌菌株。

　　淋病预防

　 1. 宣传性传播疾病知识，提倡高尚的道德情操，严禁嫖娼卖淫。

　　2. 使用安全套，可降低淋球菌感染发病率。可在性交前后各服用氟哌酸或阿莫西林，可有效的预防性病的感染。

　　3. 30天内接触过患者的性伴侣应做淋菌检查，并进行预防性治疗。性伴同时治疗。

　　4. 淋病的预防还应注意应禁止淋病病人与儿童，特别是女孩同床、共浴或公用浴盆、浴巾等。在患病率较高的地区，应对所有新生儿用硝酸银溶液或其他有效的抗生素滴眼液点眼，防止发生淋菌性眼炎。

淋病鉴别诊断

1.与男、女性淋病鉴别的疾病

　　(1)非特异性尿道炎：常有明显的发病诱因，如插导尿管、尿道探子、泌尿生殖道或邻近器官的炎症等病史。分泌物涂片染色可检出Gram阳性球菌。

　　(2)NGU：临床症状与淋病类似，但较轻，潜伏期比淋病长，达1～3周，分泌物量少且呈浆液性，排尿困难极少见，无全身症状，取分泌物作检查时常可发现衣原体或支原体。

　　(3)软下疳：损害一般位于外生殖器部位，发生于尿道口、舟状窝者有脓性分泌物，尿道口红肿和剧痛，溃疡处可检出Ducrey嗜血杆菌。

　　(4)生殖器疱疹：为HSV引起，损害为集簇性水疱，一般位于外生殖器、肛周，偶见于宫颈，发生于尿道者可有少量分泌物及尿道刺痛或不适，常伴局部烧灼感，疼痛明显，可反复发作。

　　(5)固定型药疹：有服药或注射用药史，多由磺胺类、巴比妥类、水杨酸盐类或四环素类等引起。常于外生殖器皮肤黏膜交界处发生红斑、水肿、水疱、糜烂及渗出等，伴瘙痒或疼痛，尿道口无红肿及外翻等。

　　(6)结核性尿道炎：可有尿道刺痛及少量分泌物，但无性接触史，查不到淋球菌，可查见结核杆菌，伴有其他部位结核的症状。

　　2.与男性淋病鉴别的疾病

　　(1)包皮龟头炎：常见于包皮过长或包茎者，多由包皮垢刺激及继发化脓菌感染所致，包皮内叶、龟头及冠状沟红肿，有较多的污垢及脓性分泌物，无泌尿道症状及尿道口红肿、流脓等。

　　(2)尿混浊：尿液呈乳白色，静置后有盐类结晶的沉渣，不伴有自觉症状。

　　3.与女性淋病鉴别的疾病

　　(1)念珠菌性阴道炎：外阴及阴道口瘙痒，白带较多，如水样或凝乳状，阴道黏膜红肿、糜烂，可有白膜附着于阴道壁，取白膜涂片镜检可见菌丝及孢子。

　　(2)滴虫性阴道炎：自觉阴道内有蚁行样瘙痒，阴道分泌物常呈粉红色泡沫状，阴道黏膜多有出血，宫颈可有草莓状突起物和点状出血，阴道分泌物中可检出滴虫。

　　(3)细菌性阴道病：主要为顽固性白带增多，呈灰白色，非化脓性，并带有“鱼腥样”气味，从阴道分泌物中可检出Gardner杆菌和厌氧菌。

　　(4)幼女金葡菌性外阴炎：多见于学龄前或学龄期女孩，好发于夏季，外阴、肛周红肿，有脓疱或脓性分泌物、伴疼痛或瘙痒，分泌物涂片可检出Gram阳性球菌。

　　4.与GPID鉴别的疾病

有急性阑尾炎、感染性流产、盆腔子宫内膜异位症、异位妊娠、卵巢囊肿蒂扭转或破裂等。

　　淋病检查

实验室检查：

　　淋球菌实验室检查包括涂片，培养检查淋球菌、抗原检测，药敏试验及PPNG测定，基因诊断。

　　(一)涂片检查：

　　取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，作革兰氏染色，在多形核白细胞内找到革兰氏阴性

　　双球菌。涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90%左右，可以初步诊断。女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60%，且有假阳性，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。慢性淋病由于分泌物中淋球菌较少，阳性率低，因此要取前列腺按摩液，以提高检出率。

　　咽部涂片发现革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病，因为其他奈瑟菌属在咽部是正常的菌群。另外对症状不典型的涂片阳性应作进一步检查。

　　(二)培养检查：

　　淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，只要培养阳性就可确诊，在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。目前国外推荐选择培养基有改良的Thayer-Martin(TM)培养基和New York City(NYC)培养基。国内采用巧克力琼脂或血琼脂培养基，均含有抗生素，可选择地抑制许多其他细菌生长。在36℃，70%湿度，含5%-10%CO2(烛缸)环境中培养，24-48小时观察结果。培养后还需进行菌落形态，革兰氏染色，氧化酶试验和糖发酵试验等鉴定。培养阳性率男性80%-95%，女性80-90%。

　　(三)抗原检测

　　1.固相酶免疫试验(EIA)：可用来检测临床标本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用，可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。

　　2.直接免疫荧光试验：通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免

　　疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高，特异性差，加之实验人员的判断水平，故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。

　　(四)基因诊断

　　1.淋球菌的基因探针诊断

　　淋球菌的基因探针诊断，所用的探针有：质粒DNA探针，染色体基因探针和rRNA基因探针。

　　(1)质粒DNA探针

　　① 隐蔽质粒DNA探针，淋球菌质粒分为三种：接合性质粒，分子最大，为36kb DNA; 耐药性质粒包括两个质粒，DNA长分别为5.6kb和7.1kb;隐蔽质粒4.2kb。其中隐蔽质粒存在于96%的临床淋球菌分离株中，其它奈瑟菌不含有此质粒，故可用它的序列作为特异DNA探针检测淋球菌。Torres采用核酸杂交技术检测淋球菌，所用探针为隐蔽质粒。用该探针对134株淋球菌和131株相关菌株的检测，有124株淋球菌杂交反应阳性，占93%，还可与个别其它的奈瑟菌出现交叉反应，对测定探针的敏感性实验表明可检出102CFU淋球菌。研究证明隐蔽质粒中CPPB基因序列在所有的淋球菌染色体中(包括不含该质粒的菌株)。因此CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等用CPPB基因探针检测了201份临床标本， 采用非放射性地高辛标记系统， 其敏感性和特异性分别为95%和98%。

　　② 耐药性质粒DNA探针

　　淋球菌的抗药质粒可分为：

①产青毒素酶淋球菌(PPNG)其β-内酰胺酶阳性;

②具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(TRNG)。

　　PPNG菌株是1976年首次在实验室分离得到的，该菌中含有编码产青毒酶的基因，该基因既可整合于染色体上也可出现在质粒DNA中，而后者居多，称之为产青毒素酶质粒，质粒有二种，大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998年设计一特异的检测淋球菌编码β-内酰胺酶基因的探针，采用酶化学发光法标记，液相杂交，用测光计测是特异杂交体的光量。在4h内可检测104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株虽对四环素耐药，但通常对β-内酰胺酶类及喹诺酮类抗菌素敏感。因此，在实验室药敏检测中可归为敏感细菌。Pescador用抗四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针，该基因介导抗四环素，用酶化学发光标记，液相杂交，4h内可直接从临床标本中检出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

　　(2)染色体探针

　　染色体探针包括已知功能的基因探针，如菌毛DNA探针和paI基因探针，这些基因在淋球菌感染人细胞的过程中起着重要作用;未知功能的基因探针，这些探针序列与染色体的特定序列互补，但目前还不知这些基因序列的功能。以上两种染色体探针由于在淋球菌中互补序列的拷贝数较低，检测灵敏度较低，因此一般用的不多，除非有特殊的研究目的。

　　(3)rRNA基因探针

　　rRNA基因探针是将与rRNA互补的DNA作为探针，该探针的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探针的特点是：

①可以增加探针检测的灵敏度，rRNA基因探针可同时检测rRNA分子和DNA分子;

②rRNA具有进化上的保守性;

③杂交方法简便、快速;

④由于rRNA的含量较高，标本不需增菌。美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACE C，是以rRNA 及其基因为检测靶序列，采用放射性标记，在2h内可以完成检测，Peter用这种探针检测395个临床标本，结果灵敏度和特异性分别为92.9%，99.4%，他认为PACE C系统筛查临床标本中淋球菌是一个可靠的方法。该探针还可以检测无症状淋球菌感染者，这是目前培养难于达到的。

　　2、淋球菌的基因扩增检测

　　上面讲述的探针技术检测淋球菌的方法，虽然比培养方法在灵敏度，特异性和方便性上有了很大的提高，但其仍有一定的局限性，如多数情况下需要标本的淋球菌浓度很高，PCR技术和连接酶链反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏性，它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可以直接检测临床标本中极微量的病原体。

　　(1)淋球菌DNA的提取

　　①培养菌的DNA提取

　　将培养得到的淋球菌，以102cfu/ml的浓度溶于碱性裂解液中裂解，裂解液组成为：1M NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。将裂解液混匀后煮沸1min，然后用100mol/L的1M Tris pH7.0中和碱性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次，酚—氯仿抽提一次，然后用无水乙醇或异丙醇沉淀DNA，提取的DNA溶于30mol/L蒸馏水或TE缓冲液中。

　　②临床棉拭子标本的提取

　　将贴有分泌物的棉拭子在2ml的无菌生理盐水中或PBS缓冲液中挤压洗1min，以便将标本尽量溶于溶液中，将棉拭子弃去，悬浮液于2-3000r/min离心5min，吸去上清液，细胞重新溶于100mol/L 1x PCR缓冲液，其中含Tween 20 0.45%，蛋白酶K 200μg/ml，细胞悬浮液于50-60℃温浴1h，然后95℃加热10min以灭活蛋白酶K，12000 r/min离心10min，上清液含DNA模板。

　　(2)PCR引物的设计

　　由于淋球菌隐蔽质粒CPPB基因在淋球菌染色体中和4.2kb隐蔽质粒中都有存在，同时在96%的淋球菌中都有该隐蔽质粒，因此很多PCR引物设计在CPPB基因区。

　　靶基因 引物序列 片段长度(bp)

　　CPPB NG1 5′GTT TGG CTG GTT GAT TCA AG 3′ 633

　　NG2 5′GCA AGA TTT CCG ATTT GGC G 3′

　　CPPB HO1 5′GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC 3′ 390

　　HO2 5′CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA 3′

　　rRNA 引物1 5′-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3′ 206

　　引物2 5′-ACA CTC GAG TCA CCC AGT TC-3′

　　CPPB GC1 5′CTT ATC GTT TGG CTG GTT GAT TC 3′ 435

　　GC2 5′ACC AAG ACC AAA GGT TTG ACA CTG 3′

　　GC3 5′ATT TTC CAG TGT CAA AC 3′ 241

　　GC4 5′TAT TCA AGC CCT ATC TG 3′

　　(3)PCR扩增

　　取淋球菌DNA提取液2μl，加入28μl的反应液中，最终PCR反应液中含dNTP各100μmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶1U，Mg2 1.5mmol/L，加无菌石蜡油30μl，1000r/min离心30s，进行PCR扩增循环，反应条件：94℃变性1min，然后94℃ 30s，57℃1min，72℃1min。共30个循环，最后72℃延伸5min。

　　扩增产物于2%的琼脂糖凝胶电泳30min，溴化乙锭染色，紫外灯下可见扩增的DNA荧光条带，分子大小应与所用引物扩增靶序列的大小一致。

　　(4)PCR的灵敏性和特异性

　　由于CPPB在不含有隐蔽质粒的淋球菌染色体上也会含有CPPB基因，再加96%的淋球菌都会有隐蔽质粒，因此用CPPB作为靶序列的引物具有极高的敏灵性，实验证明，一般传统一步PCR(GC1-GC2)方法可以检出3个淋球菌，而用单管巢式PCR(GC2-GC4)可以检出≤0.3淋球菌(9个CPPB基因)。这些引物经特异性实验，只能扩增淋球菌的DNA，而对非淋球菌奈瑟氏菌扩增不出特异产物。

　　(5)单管巢式PCR方法

　　是在传统巢式PCR的基础上将两对PCR引物作特殊的设计，巢式外侧两个引物(GC1，GC2)为25b退火温度比较高(68℃)，巢式内侧两个引物GC3-GC4为17b退火温度较低(46℃)，PCR反应液的其它成分与一般PCR相同。这样，通过控制退火温度(68℃)使外侧引物先行扩增，经过20-30次循环后(第一次PCR)，再降低退火温度(46℃)使内侧引物以第一次PCR产物为模板进行巢式扩增，该PCR的灵敏度可达到检出0.3个淋球菌。

　　(6)淋球菌连接酶链反应(LCP)检测方法

　　目前PCR检测淋球菌的方法被广泛地使用。其特异性，灵敏性不断提高。同时另一种基因诊断技术——连接酶链反应(LCP)也以其高特异，高灵敏性被应用于淋球菌的检测中。LCP 与PCR不同之处在于LCP 用四对引物，所用酶是连接酶。连接酶可以将两条相邻引物连接起来。连接起来的两条引物可以作为另两条引物的模板，后者在连接酶作用下连接，又可作为模板，如此进行30-40次循环。LCP所用的模板处理方法与PCR模板制备相等。LCP所用的探针除了可以设计在CPPB基因上，也可以设计在染色体基因序列上，例如opa-1基因。美国Abbott实验室在opa-1基因的48bp长的区域内设计了4个LCP探针，由于opa-1基因在淋球菌的染色体中有11次重复。因此，该组LCP探针具有高灵敏性和特异性。LCP反应过程：

　　将模板加入LCP反应液中，LCP反应液：20mmol/L Tris-HCl pH7.6;100 mmol/L KCl 10 mmol/L MgCl2;1 mmol/L EDTA; 10 mmol/L NAD ;10 mmol/L DTT，有标记物的两个相邻探针各40fmol/L，未标记的探针各40fmol/L，15U耐热连接酶，反应条件：97℃1s，55℃1s，62℃50s，其40循环。100μl反应产物加入酶标板微孔中，进行显色反应，最后用酶标仪读取光值。根据Buimer的实验证明，LCP在检测男性尿道棉拭子标本的灵敏度为100%，尿液标本为88.9%，女性宫颈棉拭子标本为95.4%。LCP方法的特异性高达100%，这一点明显高于PCR的特异性，避免了假阳性的发生。

　　3. 临床基因诊断淋球菌的注意事项

　　目前临床检测淋球菌的基因诊断方法主要采用PCR方法，但是该方法在临床检测中应注意几个问题。

　　(1)引物设计 除了以上所列的淋球菌PCR引物外，还可从在其它基因上设计，但

　　是引物序列应具有特异性。因为细菌的染色体较大，许多基因序列并没有搞清楚;同时细菌之间或近或远有一定的同源性，而且细菌所含质粒序列间也存在同源性，因此设计引物一定要进行基因数据库比较分析，同时进行特异性和灵敏性实验，从中选择引物进行临床检测。

　　(2)临床标本处理 对临床标本来讲，PCR模板要求越纯越好。这就要求在采集标本时要取到准确的位置，对于无症状患者要适当多采样，以保证采集到病原体细菌。另外由于临床标本成分比较复杂，有时简单处理的标本PCR扩增效果并不理想，这可能是由于杂质过多造成的，需要进一步纯化，如用酚一氯仿抽提法纯化，结果将会好转。这种纯化方法比较麻烦，目前已有商品化的DNA纯化试剂盒，可以较简便地从临床标本中提取高纯度的DNA。

　　(3)PCR产物的检测方法 不久以前临床PCR检测淋球菌几乎都采用电泳的方法进行PCR产物的鉴定。该方法存在许多问题，如由于肉眼观察的主观性而造成假阳性和假阴性的结果。目前用杂交显色法代替电泳法，提高了结果判断的特异性和灵敏性。

　　总之，PCR方法与LCP方法比传统的培养法在灵敏性和特异性上有了很大的提高，时间也大大缩短。随着基因诊断技术的不断改进。PCR方法与LCP方法在淋球菌的检测将会成为常规的检测方法。

　　(五)药敏试验：

在培养阳性后进一步作药敏试验。用纸片扩散法做敏感试验，或用琼脂平皿稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，用以指导选用抗生素。

　　(六)PPNG检测：

β-内酰胺酶，用纸片酸度定量法，使用Whatman I号滤纸PP-NG

　　菌株能使其颜色由蓝变黄，阳性为PPNG，阴性为N-PPNG。